淀粉发酵生产微生物多糖的研究现状

　　淀粉是食品加工业的基础原料。随着世界粮食生产的发展，淀粉产量逐年增加，淀粉行业的飞速发展，使淀粉深加工技术日益显示出重要的作用。将淀粉进行多层次深度加工，可生产改性淀粉、淀粉糖、发酵制品等几类产品约2000余种，使淀粉增值3－20倍。其中，以淀粉为原料的发酵产品，因现代生物技术日新月异的发展而获得了更加广阔的发展空间，使其成为一项市场前景好、增值多、经济效益大的淀粉深加工的重要产品之一。
　　近年来，以淀粉为原料利用生物技术开发出的新产品－微生物多糖，因其安全无毒、理化性质独特等优良性质而倍受关注。微生物糖包括胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖。胞外多糖是由微生物大量产生的多糖，易与菌体分离，可通过深层发酵实现工业化生产。一般微生物多糖是以淀粉水解为碳源发酵生产，也可直接利用可溶性淀粉经微生物酶作用制得。据D.E.Eveleigh统计，已经发现49属76种微生物产生胞外多糖，但真正有应用价值并已进行或接近工业化生产的仅十几种。近几年，随着对微生物多糖 研究的深入，世界上微生物多糖的产量和年增长量均在10％以上，而一些新型多糖年增长量在30％以上。到目前为止，已大量投产的微生物多糖主要有黄原胶（Xanthan gum）、结冷胶（Gellan gum）、右旋糖酐（Dextran）、小核菌葡聚糖（Scleeroglucan）、短梗霉多糖（Pollulan）、热凝多糖（Curdlan）等。近年来又兴起对一些新型微生物多糖如海藻糖（Trehalose）、透明质酸（Hyaluronic）、壳聚糖（Chitasan）等的研究。微生物多糖具有植物多糖不具备的优良性质，它们生产周期短，不受季节、地域和病虫害条件限制，具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。目前，许多微生物多糖已作为胶凝剂、成膜剂、保鲜剂、乳化剂等，广泛应用于食品、制药、石油、化工等多个领域。据估计，全世界微生物多糖年加工业产值可达50亿－100亿美元。现将以淀粉质为原料发酵制得微生物多糖产品的研究现状及应用情况概述如下。
1 海藻糖
　　近年来，海藻糖由于其独特的生物学功能而受到广泛的关注，在世界范围内引发了研究其生产、应用技术的热潮。
　　1．1 化学特性与生理功能
　　海藻糖是由2个分子葡萄糖残基通过1个α，α－1，1键连接的非还原性二糖。最初是从生活在沙漠中的一种甲虫蛹里分离得到的，后来发现它广泛存在于低等植物如藻类、真菌、细菌、酵母和昆虫中。大量研究表明：海藻糖具有独特而卓越的生物学特性，而在细胞中是一种典型的应激代谢物，当生物细胞处于饥饿、干燥、高温、高渗透压及有毒试剂等胁迫环境时，细胞浆内海藻糖迅速积累，对生物体膜、蛋白质发挥保护功效。最近报道海藻糖还能保护DNA防止射线引起的损伤。外源性的海藻糖，对生物体和生物大分子同样具有良好的非特异性保护作用。在海藻糖存在的条件下，对保存条件苛刻的基因工程酶类、各种病毒、疫苗、抗体和重组人蛋白的干燥及复水后的功能进行了研究，发现它们仍具有极好的稳定性和活性。
　　1．2 研究情况
　　目前已清楚了海藻糖在细胞内的代谢、调控过程，并分离、鉴定了有关海藻糖合成的基因。国内对无锡轻工业大学研究较多，国内中文期刊主要发表的是综述性文章。国外早在六七十年代就开始对海藻糖相继开展了海藻糖的生理分化、分子生物学研究，并提出了水取代作用与玻璃（或糖浆）态理论来解释海藻糖的生物保护现象。海藻糖的生产从过去的酵母提取，发展到酶法合成，甚至用重组植物生产海藻糖。在日本首次确立了以淀粉为原料，通过发酵工业化生产海藻糖的新方法，获得了大量廉价海藻糖，使其价格从1995年日本市场2万－3万日元/kg，降至现在的350日元/kg。
　　1．3 发酵法生产海藻糖研究现状
　　从酵母中提取海藻糖的生产方法成本高，收率低，大大限制了海藻糖的应用。近年来发酵生产海藻糖的开发取得了突破性的进展，并在细菌中发现了两类新酶系：海藻糖合酶、新型葡萄糖基转移酶与新型－α淀粉酶，这些酶以麦芽糖、淀粉或其水解物及寡糖为底物合成海藻糖。其中以淀粉为原料发酵生成藻糖有2种方法：一是1993年，日本Kato等分离出超嗜热嗜酸性古细菌－硫矿硫化叶菌（Salfolobus solfataricus）KM1，其细胞匀浆物中所含的新型葡萄糖基转移酶与新型α-淀粉酶联合作用于淀粉，经普鲁兰酶脱支后，可获得海藻糖，产量达80.2％－81.5％。二是1994年日本林原生物学研究所Maruta等人从土壤中分离得到一节杆菌(Arthrabacter sp.)Q36。此菌产生的人种新酶：麦芽寡糖基海藻糖合酶（MTsase）与麦芽寡糖基海藻糖合酶（MTsase），可将麦芽寡糖转化为海藻糖。以MTsase、MTHase和异淀粉酶同时作用于淀粉，最终糖化液中海藻糖收率可达80％以上。除微生物酶法生产海藻糖外，还可发酵培养真菌制取海藻糖。如有人以淀粉质原料为培养基液态培养食用菌灰树花时，研究海藻糖与多糖在灰树花中积累的规律，为今后在生物反应器内，综合开发利用食用菌的海藻糖与多糖资源提供了有价值的结果。应用生物工程技术生产海藻糖也具有诱人的前景，如美国、芬兰、荷兰等国正开展此方面的研究。但酶法水解淀粉、麦芽糖生产海藻见效快的途径。
　　1．4 应用前景
　　随着对海藻糖生产技术与工艺的改进与创新，它将日益广泛地应用于食品、医药等许多领域内。在食品中，它可作为改善于干燥加工食品质量和风味的食品添加剂与甜味剂，如用于炒鸡蛋、果泥、活性干酵母等。最近英国推出利用海藻糖保存食品的新技术，已获得英国农业、渔业、粮食部门正式批准而使用。其应用还可扩展到奶粉、果汁饮料、冷冻浓缩果汁、蔬菜汁、风味调料等多方面。它能保持食品原有的色泽、风味、质地、营养成分等。在医学和保健品方面，海藻糖可干燥保存一些对温度等环境条件敏感的核酸、蛋白质类，还可作为活菌制剂的干燥保护剂，作为进行皮肤、器官活体保存的介质。此外，海藻糖还可用来保护生物化学制品，如各种酶、培养基、探针、抗体等。总之，多功能的海藻糖通过微生物发酵法大量生产具有潜在的优势，通过进一步研究，必将会发出更多的应用途径。
2透明质酸
　　透明质酸（HA），又称玻璃酸，是一种酸性粘多糖，广泛存在于生物的结缔组织中，早期HA主要从人脐带和鸡冠中提取制备，现已发展到采用微生物发酵法制备透明质酸，为HA的来源又寻找了另一条途径。由于HA价格高、用途广，多年来对HA的研究一直倍受不者们的关注。
　　2．1 化学结构与生理功能
　　HA是由（1→3）－2－乙酰氨基－2－脱氧－β－D－葡萄糖－（1→4）－O-β- D-葡萄糖醛酸双糖重复单位组成的直链多糖，其结构非常规则，相同的双糖单位为HA的基本结构单元，不同动物组织和细菌来源的HA的基本结构单元，不同动物组织和细菌来源的HA无科属差异。HA分子式为（C14H22NaO11）11，其分子链的长度及分子量是不均一的，分子量范围为2×105－7×1016之间。正是由于HA具有线性分子链结构，使其具有较强的粘度和保水作用。
　　HA以其独特的分子结构和理化性质，在有机体内显示多种重要的生理功能。HA具有润滑关节，调节血管壁通透性，调节水、蛋白质、电解质的扩散及运转，促进创伤愈合等作用。
　　2．2 透明质酸的生产
　　1934年，Meyer和Panlmer从牛眼玻璃体中最先分离出HA。此后，人们对HA开展了全面、深入的研究，逐渐清楚了其化学结构、理化性质、生理功能，建立了不同的制备工艺，并不断开发HA在医疗、化妆品等方面的应用。国内从80年代起研究HA的分离纯化及临床应用，由山东省生物药物研究开始进行HA发酵研究，90年代初已有HA制剂作为新药上市，生产方法由提取法发展到微生物发酵法。在国外，日本对此研究较集中。日本资生堂首先开始了工业化生产水平的HA发酵研究。目前HA的发酵水平已人2－4g/L提高到6－7g/L，而价格则下降了约50％。
　　发酵法生产作为HA的新来源，不仅大大降低了HA的生产成本，而且提高了HA的产量，改善了产品的质量。目前HA发酵所用菌种多种链球菌属中致病性较弱的Ｃ菌群，经紫外线照射或诱变剂处理的发酵产率较高的诱变菌种应用于生产中。发酵生产HA分二步：由细菌经相应的生物反应过程生物合成HA；提取纯化HA。一般工艺流程为：试管菌种接入三角瓶中37℃摇瓶培养12－18h，接入已灭菌的种子罐，接种比例1：200，培养12－18h，镜检合格（菌体生长良好，无杂菌）接入发酵罐，接种比例1：10，发酵过程中检测各参数。发酵结束后，杀灭除去菌体，用乙醇、氯代十六烷基吡啶沉淀、超滤以分离纯化，有机溶剂沉淀，真空干燥得白色纤维状或粉末状终产品。此发醇过程的决定因素在于菌种、培养基及分离提纯工艺。据日本专利报道，用NTG(N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍)二步诱变兽疫链球菌得HA酶缺陷型变异株Y-921，其HA产率高达6.7g/L。
　　2．3 应用前景
　　发酵生产HA的工业化给它的应用带来了广阔的发展前景，大量低廉的HA将在多领域得到广泛的应用。如HA具特殊的保水作用，被誉为＂理想的天然保温因子＂，它可改善皮肤营养代谢，使皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱，增加弹性，防止衰老。含HA的化妆品被国际上公认为＂仿生化妆品＂、＂第四代化妆品＂。HA还具较强的粘度，用于临床医学，可促进组织再生重塑和伤口愈合。此外，HA还具有生物粘附性、生物相溶性、生物降解性的特点，可做良好的药物载体如透皮吸收剂，在皮肤外用药剂中做载体使用，缓释药物并促进药物的透皮能力，促进皮肤对药物的吸收。如日本的一项专利＂皮肤外用剂组成物＂、我国山东某制公司生产的滴眼液，都是利用HA这一特性的应用实例。
3　壳聚糖
　　壳聚糖学名聚氨基葡萄糖，又名可溶性甲壳质，在自然界中的含量十分丰富，其贮量仅次于纤维素的第二大天然聚合物，在许多方面有着广泛的用途。很早以前国外就开始壳聚糖的开发及应用研究，日本对其研究较早。我国此研究始于80年代，90年代开始活跃起来，现又成为热门课题之一。
　　3．1 壳聚糖的性质
　　壳聚糖是甲壳素（Chitin）经脱乙酰化处理后的产物，是由N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接起来的不分枝的链状高分子化合物，其理化性质主要取决于乙酰化率和聚合度。由于壳聚糖具有良好的生物相溶性、可生物降解性以及无毒、无副作用，且其分子内含有－OH和－NH2活性基团，易与多种有机物发生反应。
　　壳聚糖的脱乙酰度是壳聚糖的重要性质之一，它表明在聚多糖中的自由氨基的量，其检测方法很多。壳聚糖的分子量与粘度也是其重要指标。一般说粘度越大，分子量越大。
　　3．1 壳聚糖的制备
　　3．2．1 常用方法 壳聚糖制备方法以碱液法为最常用的方法。其工艺流程为：
　　虾、蟹壳→用稀碱溶液更替浸泡→水洗→酸浸泡至无气泡产生→漂白→浓碱煮沸3－4h→干燥→成品。
　　3．2．2 发酵方法 目前工业生产壳聚糖以提取法为主，但由于真菌等微生物具有壳聚糖的潜在资源，近年来人们开始了其发酵法生产的研究。以黑曲霉为发酵菌株，将培养成熟的发酵液过滤、水洗、干燥，提取成品。据报道，我国首创的利用废菌丝体发酵生产壳聚糖等生化产品的技术，近期通过了国家石化局的鉴定和验收，该成果壳聚糖发酵水平达15.3g/L，提取收率达81％，壳聚糖脱乙酰度大于80％，此技术具有很好的推广应用前景。
　　3．3 应用前景
　　壳聚糖是一种带正电荷的天然高分子多糖，这可能是该物质生理化和生物学功能的基础，现已表明壳聚糖已在医药、食品化工、生物技术、农业、环保等领域有着良好的应用性能。在医药方面，壳聚糖可用作杀虫抑菌剂、医用纤维和膜、药物载体及凝血剂等。食品工业中利用其絮凝特性做液体处理剂，又以其无毒性及成膜性广泛用作食品添加剂和用于果蔬保鲜上。在生物技术方面，由于壳聚糖不存在的残存单体，它可作为酶载体。Ghosh等已进行了此方面的研究。此外，壳聚糖也可用于细胞微囊和冷冻保存细胞的担体。在农业方面被认为是一种新型植物生长调节剂、土壤改良剂、植物病害诱抗剂、种衣剂等。
4　黄原胶及其它
　　黄原胶又称汉生胶、黄胶等，是黄单孢杆菌产生的胞外杂多糖的统称。自黄原胶问世以来，各国学者对其进行了大量的研究，发现它具有良好的增稠性、假塑流变性、悬浮性、乳化稳定性、耐酸耐碱、抗盐、抗温、优良的兼容等性能。美国的Kelco公司早在60年代初即开始了大量商业化生产黄原胶。世界上生产黄原胶的国家和地区有10余个。我国自70年代以末黄原胶工业也从无到有，迅速发展起来。目前黄原胶的生产主要以淀粉、淀粉水解糖浆为底物，由黄单胞杆菌发酵制得。黄原胶广泛应用于食品、医药、日化、石油等20余个行业，有30－40个品种。近30年来，对黄原胶的需求量年均增长5.7％，它已成为世界上生产规模最大、用途较广的微生物多糖。
　　除了上述4种微生物多糖外，热凝胶又称热凝多糖也是一类具有特殊性质的微生物多糖。该糖可形成热不可逆凝胶，具有食用和多种工业用途。美国FDA于1996年准许将其作为食品的稳定剂、增稠剂用于食品配料中，日本、加拿大等国已有生产。目前，我国江苏省食品发酵研究所采用微生物发酵法生产热凝胶的工艺已基本完成工业性的试验，正致力于实际工艺已基本完成工业性的试验，正致力于实际工业化生产的前期准备工作。另外，还有环糊精、结冷胶、短梗霉多糖、右旋糖酐、D-核糖、小核菌葡聚糖等微生物多糖可通过微生物直接或间接利用淀粉发酵制得。这些多糖中部分已实现工业化大量生产并广泛应用，部分仍处于试验阶段，但都展示出诱人的发展前景。
　　综上所述，微生物多糖的工业化生产和应用有着巨大的发展潜力。以淀粉为原料的诸多发酵产品中的海藻糖、透明质酸、壳聚糖和黄原胶等具有较大市场容量。海藻糖、透明质酸和壳聚糖是近年来合成途径，其中利用微生物水解淀粉的生产可能是短期见效的可行途径。黄原胶是世界上用途极广的微生物多糖，由于它有良好的抗剪切、抗盐、耐酸碱、耐高温等特性，使黄原胶的用途已由早年用于石油钻井向医药食品转移。D-核糖既可直接用于医药产品，又是维生素B2的生产原料，只要合成方法稍加改进，其生产成本会明显低于现有任何生产方法，是一个很有前途的产品。
　　以淀粉为原料的微生物多糖发酵产品的生产，具有原料来源丰富廉价，生产不受区域和气候条件的影响等优点，为淀粉深加工产业开辟新市场、新用途，为消费者提供了崭新的产品，且使普通的农产品大幅度增值，为玉米进入高效农业做出了贡献。因此，应充分利用我国丰富的淀偻资源，采用高新技术，深入开展淀粉发酵微生物多糖的研究及产品开发，促进以淀粉为发酵原料的工业化生产迅速发展。